Исследование биоэквивалентности ветеринарных препаратов на основе флураланера: ВЕПРИПАК® и БРАВЕКТО®
1 ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН (109316, Москва, ул. Талалихина, д. 26).
2 ООО «Ветстем» (121205, г. Москва, тер. Сколково инновационного центра, Большой бульвар, д. 42, стр. 1).
Общие сведения: флураланер представляет собой эктопаразитицид системного действия, обеспечивающий долгосрочное уничтожение блох и клещей у собак после однократного перорального приема. На основе данного соединения компанией ООО «ВЕТСТЕМ» разработан новый ветеринарный ЛП «Веприпак®».
Цель исследования: изучить фармакокинетическую биоэквивалентность воспроизведенного ЛП «Веприпак®» и референтного ЛП «Бравекто®» при применении собакам.
Результаты: ВЭЖХ-МС/МС-анализ установил фармацевтическую эквивалентность препаратов: время достижения пиковой концентрации (Tmax) флураланера в сыворотке крови в среднем составило 48 ч для обоих препаратов; пиковые концентрации в плазме (Cmax) составили 7958,6 нг/мл для исследуемого ЛП и 7987,0 нг/мл для референтного ЛП; 90%-е доверительные интервалы соотношений CmaxT/CmaxR и AUC0-tT/AUC0-tR флураланера находились в пределах диапазона 80…125 %.
Выводы: полученные результаты служат достаточным основанием для признания фармакокинетической эквивалентности воспроизведенного препарата референтному.
Ключевые слова: флураланер, Веприпак® , Бравекто®, фармакокинетика, биоэквивалентность, собаки.
Сокращения: ВЭЖХ-МС/МС (HPLC–MS/MS) — высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry), ГАМК (GABA) — гамма-аминомасляная кислота (gamma-aminobutyric acid), ДВ (API) — действующее вещество (active pharmaceutical ingredient), ЛП (MP) — лекарственный/е препарат/ы (medicinal product), п/к (s.c.) — подкожно (subcutaneous).
Введение
Более 10 лет назад был разработан эктопаразитицид — флураланер, представляющий собой важное достижение в области контроля заражения эктопаразитами у собак. Флураланер принадлежит к новому классу соединений с противопаразитарным эффектом — изоксазолинам. Эти соединения действуют на ГАМК- и глутаматзависимые хлоридные каналы и обладают значительной селективностью в отношении нейронов членистоногих в сравнении с нейронами млекопитающих, обеспечивая контроль инвазии блохами и клещами на протяжении 12 недель после однократной дачи внутрь. Столь существенная продолжительность действия обеспечивает более удобное лечение по сравнению с препаратами против блох и клещей, предназначенными для ежемесячного применения, что потенциально может способствовать повышению комплаентности.
Начиная с 2010 года проводятся исследования по изучению способа применения, всасываемости и эффективности флураланера на различных видах животных в которых показана высокая его эффективность [6…8]. Широко известным и зарекомендовавшим себя, в том числе на российском рынке, является препарат «Бравекто®».
С целью повышения доступности препаратов для владельцев животных компания ООО «Ветстем» разработала ветеринарный ЛП «Веприпак®», представляющий собой фармацевтический аналог оригинального препарата «Бравекто®».
Препараты «Бравекто®» и «Веприпак®» применяют для лечения и профилактики блошиной инвазии у собак; в комплексной терапии аллергического дерматита, вызванного блохами; акарозов, вызванных иксодовыми клещами; для лечения демодекоза, саркоптоза и отодектоза; для снижения риска возникновения бабезиоза.
Референтный и воспроизведенный препараты выпускают в форме таблеток. Препараты «Бравекто®» и «Веприпак®» в зависимости от массы таблетки содержат в качестве ДВ 112,5 мг, 250 мг, 500 мг, 1000 мг и 1400 мг флураланера.
Препарат «Веприпак®» также содержит вспомогательные вещества: ароматизатор из свиной печени, сахарозу, натрия лаурилсульфат, динатрия памоата моногидрат, магния стеарат, аспартам, глицерин, соевое масло (стабилизированное 0,1% бутилокситолуола), полиэтиленгликоль (Макрогол 3350), кукурузный крахмал.
Фармакокинетическую биоэквивалентность ЛП «Бравекто®» и «Веприпак®» изучали на целевой группе животных для данных ЛП (собаках).
Цель исследования
Сравнить биоэквивалентность двух препаратов на основе флураланера, предназначенных для ветеринарного применения: ЛП «Веприпак®» (производитель ООО «Ветстем», РФ) и ЛП «Бравекто®» (Intervet GmbH, Австрия) при однократном пероральном введении целевому виду животных — собакам.
Материалы и методы
Эксперимент был проведен на 16 клинически здоровых собаках породы английский бигль, самцы (n=8) и самки (n=8), полученных из разведения, возрастом от 18 до 24 месяцев, массой 15,43±0,76 кг. В течение 90 суток до начала исследования животные не получали препаратов с ДВ флураланер; в течение не менее чем 30 суток до начала исследования им не применяли иных антигельминтных и антипаразитарных препаратов широкого спектра действия. Во время исследования соблюдали принципы гуманного отношения к экспериментальным животным [Директива 2010/63 EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях]. Был использован последовательный дизайн исследований, что соответствует требованиям законодательства в части исследования биоэквивалентности [Приказ Минсельхоза от 6 марта 2018 г. No 101 «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения»].
Препараты вводили собакам перорально, однократно, индивидуально незадолго до кормления, во время или вскоре после него, в терапевтической дозе 30,96..33,61 мг ДВ флураланера на 1 кг массы животного.
Пробы крови у каждого животного брали за 10 мин до введения препарата (0) и после введения через 2, 4 и 8 ч, затем через сутки и далее на 2-е, 3-е, 4-е, 7-е, 14-е, 21-е, 28-е, 35-е, 42-е, 49-е, 56-е, 63-и, 70-е, 77-е и 84-е сутки.
Концентрацию ДВ флураланер в сыворотке крови собак определяли методом ВЭЖХ-МС/МС в двух повторах.
Исследование выполняли на системе для ВЭЖХ Agilent 1200 с трехквадрупольным масс-спектрометром Agilent 6410B с использованием хроматографической колонки Poroshell 120 EC-C18 4.6 мм × 50 мм, 2.7 мкм (p/n 699975-902) (Agilent Technologies, США): температура колонки — 30 °С; скорость потока подвижной фазы — 0,4 мл/мин; объем вводимой пробы — 10 мкл; время анализа — 5 мин. Разделение проводили в режиме градиентного элюирования (двухкомпонентная подвижная фаза). Использовали ионизацию электрораспылением и следующие оптимизированные параметры масс-спектрометрического детектирования: температура газа для десольватации 350 ºС; расход газа для десольватации 12 л /мин; давление иглы распылителя 50 psi (345 кПа). Условия детектирования оптимизировали в ручном режиме. Напряжение на фрагменторе определяли, варьируя с шагом 10 В по максимальному отклику протонированного молекулярного иона, энергию диссоциации оптимизировали с шагом 2 В по максимальному отклику характерного иона-продукта, при этом, соотношение сигнал / шум иона-продукта должно быть не менее 1 : 10. Детектирование аналитов проводили методом «регистрации выбранных реакций».
Для вычисления концентраций ДВ флураланер использовали программное обеспечение MassHunter Workstation Software В.09.00, с помощью которого получали данные о количественном содержании в нг/мл в пробе без учета разведения и массы навески сыворотки крови, на основе полученного сигнала рассчитывали содержание ДВ флураланер [1…3].
Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью ПО Microsoft Excel 2013, IBM SPSS Statistics 10 (США). Обработка полученных индивидуальных данных включала в себя нахождение средних величин, относительных стандартных отклонений от средних (mean±SD), медианы (Ме) и межквартильного размаха (P25 и P75). Все расчеты фармакокинетических показателей производили с использованием программы-надстройки PKSolver для Microsoft Excel, свободно доступной и написанной на Visual Basic для приложений (VBA) [4]. Для оценки статистической значимости различий использовали критерий Манна -Уитни, статистическая значимость (значение р) принята за 0,05.
Результаты
Дозирование проводили целыми таблетками с содержанием ДВ флураланер 500 мг, поэтому каждая собака получила дозу, приблизительно равную целевой: 30,96..33,61 мг ДВ флураланер на 1 кг массы животного (табл. 1). У животных после введения ЛП «Веприпак®» и «Бравекто®» на протяжении всего периода наблюдения, составившего 84 суток после введения, не отмечено никаких нарушений в физиологическом состоянии: собаки были подвижны и активны; мышцы в тонусе; тактильная реакция сохранена; шерсть гладкая, чистая, блестящая, плотно прилегающая к телу; кожный покров эластичный, без нарушения целостности; видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, без признаков воспалительных реакций; глаза яркие, блестящие; акты мочеиспускания и дефекации соответствовали физиологической норме. В течение эксперимента сохранность животных была полной. На основании полученных данных установлено, что ДВ флураланер обнаруживается в сыворотке крови собак уже через 2 ч после введения препаратов «Веприпак®» и «Бравекто®».
1. Доза препарата и содержание действующего вещества во введенной дозе
1.1 ЛП Веприпак®
| № собаки | Масса тела, кг | Доза препарата, мг | Количество ДВ флураланера, мг/кг |
|---|---|---|---|
| 1 | 15,3 | 500 | 32,68 |
| 2 | 14,9 | 500 | 33,56 |
| 3 | 16,1 | 500 | 31,06 |
| 4 | 16,5 | 500 | 30,30 |
| 5 | 14,8 | 500 | 33,78 |
| 6 | 15,8 | 500 | 31,65 |
| 7 | 16,3 | 500 | 30,67 |
| 8 | 14,4 | 500 | 34,72 |
| Ме | 15,55 | 500 | 32,30 |
| P25…P75 | [14,88…16,15) | - | [30,96…33,61] |
1.2 ЛП Бравекто®
| № собаки | Масса тела, кг | Доза препарата, мг | Количество ДВ флураланера, мг/кг |
|---|---|---|---|
| 9 | 15,4 | 500 | 32,47 |
| 10 | 14,2 | 500 | 35,21 |
| 11 | 16,4 | 500 | 30,49 |
| 12 | 15,5 | 500 | 32,26 |
| 13 | 14,3 | 500 | 34,97 |
| 14 | 15,4 | 500 | 32,47 |
| 15 | 16,3 | 500 | 30,67 |
| 16 | 15,3 | 500 | 32,68 |
| Ме | 15,4 | 500 | 32,50 |
| P25…P75 | [15,05…15,70) | - | [31,86…33,25) |
Для препарата «Веприпак®» пиковая концентрация Cmax ДВ флураланер в сыворотке крови собак отмечалась между первыми и вторыми сутками после приема и составляла 7676,56 [7568,89…8388,99] нг/мл. Концентрация ДВ флураланер в сыворотке крови собак постепенно снижалась, однако не достигала нижнего предела количественного определения метода (10 нг/мл) даже через 84 сут. Подобная картина наблюдалась после приема референтного препарата «Бравекто®»: концентрация ДВ флураланер в сыворотке крови собак достигала максимума между первыми и вторыми сутками после приема, составляя 7853,46 [7586,98…8412,12] нг/мл. В дальнейшем его концентрация в сыворотке крови собак постепенно снижалась, однако не достигала нижнего предела количественного определения метода (10 нг/мл) даже через 84 сут. Изменение концентрации ДВ флураланер в сыворотке крови собак представлено в таблице 2 и на рисунке. Сравнительные фармакокинетические параметры ДВ флураланер при применении препаратов «Веприпак®» и «Бравекто®» приведены в таблице 3.
2. Результаты исследования ДВ флураланер в сыворотке крови собак при введении ЛП Веприпак® и Бравекто® (Mean±SD, нг/мл сыворотки крови)
| № п/п пробы | Время взятия крови | Веприпак® | Бравекто® |
|---|---|---|---|
| 0 | -0,10 | <НПКО | <НПКО |
| 1 | 2 ч | 1053,09 ± 154,2 | 1106,84 ± 148,09 |
| 2 | 4 ч | 3890,42 ± 237,60 | 3953,28 ± 252,81 |
| 3 | 8 ч | 4718,67 ± 521,95 | 5286,09 ± 562,00 |
| 4 | 1 сут | 7192,32 ± 897,58 | 7646,00 ± 773,69 |
| 5 | 2 сут | 7958,58 ± 611,89 | 7986,96 ± 706,57 |
| 6 | 3 сут | 7718,71 ± 608,71 | 7827,58 ± 618,51 |
| 7 | 4 сут | 6893,03 ± 243,08 | 6883,11 ± 312,33 |
| 8 | 7 сут | 4363,47 ± 268,14 | 4479,79 ± 286,82 |
| 9 | 14 сут | 3358,87 ± 146,88 | 3414,57 ± 173,11 |
| 10 | 21 сут | 2219,96 ± 133,33 | 2199,47 ± 83,16 |
| 11 | 28 сут | 1150,91 ± 81,52 | 1165,39 ± 76,48 |
| 12 | 35 сут | 725,50 ± 60,06 | 717,22 ± 45,15 |
| 13 | 42 сут | 636,50 ± 34,42 | 666,52 ± 29,70 |
| 14 | 49 сут | 517,80 ± 32,80 | 522,59 ± 35,63 |
| 15 | 56 сут | 445,91 ± 26,06 | 435,53 ± 15,28 |
| 16 | 63 сут | 358,38 ± 28,23 | 336,12 ± 23,61 |
| 17 | 70 сут | 242,60 ± 26,29 | 235,20 ± 18,17 |
| 18 | 77 сут | 194,52 ± 9,88 | 192,51 ± 12,95 |
| 19 | 84 сут | 77,87 ± 4,37 | 112,67 ± 119,77 |
Наличие/отсутствие биоэквивалентности между воспроизведенным ЛП «Веприпак®» и референтным препаратом «Бравекто®» оценивали в соответствии с Правилами проведения исследований биоэквивалентности лекарственных средств Евразийского экономического союза (Решение Евразийской экономической комиссии № 85). Исследуемые препараты считаются биоэквивалентными, если, 90%-й доверительный интервал для отношения среднего значения каждого из перечисленных фармакокинетических параметров, за исключением Cmax, для исследуемого препарата к среднему значению для препарата сравнения находится в пределах 0,80…1,25. Для Cmax
3. Результаты определения фармакокинетических показателей ДВ флураланер ЛП Веприпак® и Бравекто®
| Параметр | Ед. изм. | Веприпак® | Бравекто® |
|---|---|---|---|
| Lambda_z, | 1/h | 0,002 | 0,002 |
| T1/2 | h (day) | 327,84 (13,66) | 410,32 (17,09) |
| Tmax | h (day) | 48 (2) | 48 (2) |
| Cmax | ng/ml | 7958,58 | 7986,96 |
| Clast_obs/ Cmax |
- | 0,010 | 0,0174 |
| AUC 0-t | ng/ml*h | 3098101,35 | 3138635,90 |
| ng/ml*da | 129087,59 | 130776,50 | |
| AUC 0-∞ | ng/mJ*h | 3134932,90 | 3205330,24 |
| ng/ml*day | 130622,20 | 133555,42 | |
| AUC 0-t/0-∞ | - | 0,988 | 0,979 |
| MRT 0-inf obs |
day | 18,5 | 19,2 |
| Vz/F obs | (mg)/(ng/ml) | 0,075 | 0,092 |
| Cl/F obs | (ng)/(ng/ ml)/h |
Не применимо | Не приме- нимо |
Примечание:
Lambda_z — константа скорости элиминации; t1/2 — период полувыведения ДВ; Cmax — максимальная (пиковая) концентрация ДВ в сыворотке крови после п/к введения; Tmax — время достижения Cmax исследуемого ДВ в сыворотке крови после п/к введения; Clast_obs/Cmax — последняя наблюдаемая концентрация, поддающаяся количественному определению относительно Cmax; AUC0-t — площадь под кривой концентрация-время от 0 до последней временной точки; AUC0-∞ — площадь под кривой концентрация-время от 0 до бесконечности; MRT 0-inf_obs — среднее время сохранения ДВ в сыворотке крови; Vz/F_obs — видимый объем распределения; Cl/F_obs — кажущийся системный клиренс действующего вещества после введения.
Соответствующие пределы составляют 0,70…1,43. Определение 90%-го доверительного интервала проводят при помощи параметрических методов анализа, после логарифмической трансформации значений фармакокинетического параметра.
Биоэквивалентность препаратов оценивали на основе предположения о логнормальном распределении измеренных параметров Cmax, AUC(0-t), AUC(0-∞) и Cmax/AUC(0-t).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что 90%-е доверительные интервалы для отношений Cmax и AUC0 «Веприпак®» и «Бравекто®» находятся в пределах диапазона 80–125, и, следовательно, гипотеза о биоэквивалентности препаратов «Веприпак®» и «Бравекто®» принимается.
Заключение
Результаты исследования сравнительной фармакокинетики воспроизведенного препарата «Веприпак®» и референтного препарата «Бравекто®» на собаках продемонстрировали, что они фармацевтически эквивалентны:
- двусторонний доверительный интервал для соотношения Cmax находится в диапазоне от 70,0 до 143,0 %;
- двусторонний доверительный интервал для соотношений AUC0-t и AUC0-∞ находится в диапазоне 80,0…125,0 %;
- двусторонний доверительный интервал для соотношений Cmax/AUC0-t находится в диапазоне 75…133 %.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что биофармацевтические свойства препарата «Веприпак®» сопоставимы с аналогичными свойствами препарата «Бравекто®», ранее зарегистрированного в Российской Федерации на основании результатов доклинических и клинических исследований, подтвердивших его качество, эффективность и безопасность.
Полученные результаты исследований продемонстрировали наличие достаточных оснований для признания безопасности и эквивалентной терапевтической активности разработанного в РФ препарата «Веприпак®».
Конфликт интересов
Производителем препарата Веприпак® и спонсором данного исследования является ООО «Ветстем». Решение о публикации результатов научной работы принадлежит разработчику ООО «Ветстем».
Библиография
-
Currie, G.M. Phannacology, Part 2: Introduction to Phannacokinetics / G.M. Currie // J Nucl Med Technol. — 2018. — Vol. 46. — No. 3. — pp. 221-230. doi: 10.2967/jnmt.117.199638.
-
Белоусов, Ю.Б. Общая и частная клиническая фармакокинетика / Ю.Б. Белоусов, К.Г. Гуревич. — М.: Ремедиум, 2006. — 807 с.
-
Горьков, В.А. Введение в фармакокинетику. Клиническая фармакокинетика / В.А. Горьков, Е.И. Карамышева // Фармакокинетика и Фармакодинамика. — 2004. — №1. — С. 2-4.
-
Zhang, Y. PKSolver: An add-in program for phamacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel / Y. Zhang, M. Huo, J. Zhou, S. Xie // Comput Methods Programs Biomed. — 2010. — Vol. 99. — No. 3. — pp. 306-14. doi: 10.1016/j.cmpb.2010.01.007.
-
Соколов, А.В. Правила исследования биоэквивалентности / А.В. Соколов // Клиническая фармакокинетика. — 2004. — №1. — С. 5-13.
-
Walther, F.M. The effect of food on the pharmacokinetics of oral fluralaner in dogs / F.M. Walther, M.J. Allan, R.K. Roepke, M.C. Nuernberger // Parasit Vectors. — 2014 Mar. — Vol. 5. — No. 7. — pp. 84. doi: 10.1186/1756-3305-7-84.
-
Kilp, S. Comparative pharmacokinetics of fluralaner in dogs and cats following single topical or intravenous administration / S. Kilp, D. Ramirez, M.J. Allan, R.K. Roepke // Parasit Vectors. — 2016 May. — Vol. 31. — No. 9(1). — pp. 296. doi: 10.1186/s13071-016-1564-8.
-
Berny, P.J. Fecal elimination of fluralaner in different carnivore species after oral administration / P.J. Berny, D. Belhadj, B. España, A. Lécu // Frontiers in Veterinary Science. — 2024 Aug. — Vol. 16. — No. 11. — pp, 1279844. DOI.10.3389/fvets.2024.1279844.
